По окончанию научно-инженерного курса Рентген, следую совету своего будущего наставника физика Августа Кундта, обратился к экспериментальной физике, которой он еще не занимался вплотную. Уже в 1869 году, через год после инженерного экзамена, он получил за статью по теории газа степень доктора философии. В отзыве на его диссертацию отмечаются «добротные знания, самостоятельный творческий талант в области математической физики».

В 1870 году Августа Кундта пригласили в Вюрцбургский университет, в месте с собой он взял своего молодого ассистента. Несмотря на свои отличные успехи по специальности и двойной диплом высшей школы, Рентгену не удалось добиться допуска к конкурсу на доцентуру. В Цюрихском университете при присуждении докторской степени на отсутствие аттестата зрелости великодушно закрыли глаза. В Вюрцбургской Alma mater царили строгие порядки, против которых было бессильно и заступничество Кундта. Но уже в 1872 году Кундт был приглашен во вновь созданный Имперский университет в Страсбурге. Эта высшая школы была свободна от академический пережитков, и при поддержки крупного химика, будущего лауреата Нобелевской премии Адольфа фон Байера, молодому физику удалось в 1874 году получить право на преподавание, несмотря на отсутствие аттестата. Уже через год Рентген стал профессором математики и физики в Высшей сельскохозяйственной школе в Гоенгейме. В этом учебном заведении, в котором у него не было возможностей для экспериментальной работы, он оставался только два семестра, после чего он вернулся в Страсбург как экстраординарный профессор математической физики.

В университете Гисена в 34 года Рентген получает кафедру экспериментальной физики. В этот период он опубликовал относительно немного робот. Но его работы показали смелое и образцово чистое экспериментаторское искусство и были очень многосторонни по своей тематике. В области науки Рентген не был узким специалистом, но он преимущественно занимался вопросами электромагнетизма и оптики. Больше всего Рентген любил работать простыми приборами, а также в лаборатории, а не в кабинете за письменным столом. Он отлично умел строить приборы и аппараты, необходимые для исследования и преподавания, с их помощью он достигал результатов высочайшей точности.

В Гисене Рентген сделал важное открытие. Основываясь на электродинамике Фарадея-Максвелла, он обнаружил магнитное поле движущегося электрического заряда. Тем самым он создал существенную предпосылку для обоснования теории электронов. Открытое Рентгеном явление Лоренц назвал «рентгеновским током».

Через десять лет успешной исследовательской и преподавательской деятельности Рентген был приглашен в Вюрцбург, после того как он ранее отклонил предложения из Йены и Утрехта. Теперь он как профессор возвратился в тот университет, который двадцать лет назад, руководствуясь своими правилами, отказал ему в приват-доцентуру.

В Вюрцбурге он опубликовала семнадцать работ, которые касались исключительно экспериментальных исследований. Свои специальные публикации он старался рассылать коллегам во все мире. Перечень адресов ученых, с которыми он обменивался публикациями, охватывает около ста имен. Среди зарубежных коллег были Аррениус, Лоренц, Рэлей, Роуланд, Тиндаль, Вильям Томсон и Ван-дер-Ваальс. В 1894 году Рентген был избран ректором Вюрцбургского университета. Его ректорская речь была посвящена истории в Вюрцбурге. Эксперимент, говорил он, является могущественнейшим рычагом, с помощью которого мы можем отвоевать у природы ее тайны, он постоянно должен образовывать «высочайшую инстанцию» в решении вопроса о том, сохранить ту или иную гипотезу или отказаться от нее. Каждое явление должно быть прежде всего как можно более точно во всех частностях подвергнуто наблюдению и описанию; лишь после этого можно отважиться на истолкование.